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血清總補體溶血活性(CH50)測定操作說明書

點擊次數:1169  日期:2018/7/6 12:37:36

血清總補體溶血活性(CH50)實驗原理
利用綿羊細胞與相應抗體(溶血素)結合成的復合物,可激活血清中的補體,導致紅細胞溶解,當紅細胞和溶血素量一定時,在規定反應的時間內,溶血程度與補體量及活性呈正相關。在接近50%溶血(CH50)時,二者之間近似直線關系,故以50%溶血作為最敏感的判斷終點。以引起50%溶血所需的最小補體量為一個CH50U,可計算出待測血清中總的補體溶血活性,以CH50U/ml表示。
 
本試驗主要反映補體經典活化途徑的溶血功能,其結果與補體C1~C9各組成分的量及活性均有關。
1.試劑及配制
(1)緩沖生理鹽水:
①貯存液:
lNa2HPO4•12H2O     2.85g
lKH2PO4             0.27g(加蒸餾水至100毫升,4℃保存)
lNaCl               17.00g
②應用液(緩沖液):5毫升貯存液加95毫升蒸餾水,再加10%硫酸鎂0.1毫升。當日配制。12小時內使用。
(2)2%綿羊紅細胞(From:南京森貝伽生物公司):無菌采取綿羊血液,于等量Alsever液中可保存3周。用前以緩沖液洗3次,并配成2%細胞懸液。必要時可用吸光光度法或細胞計數法使懸液細胞濃度標準化。
(3)凍干綿羊紅細胞溶血素(From:南京森貝伽生物公司)(規格:0.5ml/瓶,0.5ml蒸餾水復溶):將本品(效價1:4000),用緩沖液作1:2000倍稀釋(即0.5ml溶血素加999.5毫升緩沖液)。
(4)待測血清:新鮮血液室溫放置30分鐘,再4℃放置60分鐘,使血塊收縮。4℃離心(3000r/min)10分鐘,取上清,-20℃保存。
2.試管法操作步驟(改良Mayer法)
(1)致敏羊紅細胞:2%綿羊紅細胞加等量稀釋后的溶血素(1:2000),混勻,置37℃水浴30分鐘。
(2)稀釋血清:待測血清0.2ml,加緩沖液3.8ml,稀釋度為1:20。
(3)配制溶血標準管:2%綿羊紅細胞2ml加8ml蒸餾水,混勻,即為全溶血管。取全溶血管液2ml加緩沖液2ml,即為50%溶血管。
(4)按表所示,依次加各成分于試管中,混勻,置37℃水浴30分鐘。第10管為非溶血對照。

補體CH50測定試管法

    

          

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

120待測血清

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

-

緩沖液(ml)

1.40

1.35

1.30

1.25

1.20

1.15

1.10

1.05

1.00

1.50

致敏紅細胞(ml

1

1

1

1

1

1

1

1

1

1

(5)結果測定:取出試管,2000r/min離心10分鐘,對照管應不溶血。肉眼比色,選與50%溶血標準管相近二管,再用分光光度計測(波長542nm、0.5cm比色杯)OD值,確定與標準管最接近者為終點管,然后按下公式計算CH50值:血清補體CH50(U/ml)=(1/血清用量)×稀釋度。
如第5管為終點管,測待測血清中CH50為66.7U/ml。血清補體CH50正常值為50-100U/ml。
 
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